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DCypherTM: 以高靈敏度和特異性詢問染色質讀數器鑒定和評估讀數器與核小體結合的測定 epicypher產品測定 epicypher產品測定

概述: 詢問染色質閱讀器表觀遺傳閱讀器蛋白因其在細胞功能中的重要作用以及靶向藥物開發治療癌癥等疾病的潛力而受到廣泛關注。經典的方法依賴于組蛋白肽拉降序列來詢問染色質閱讀器的結合偏好1。然而，這些方法由于低靈敏度和/或高背景而受到高失敗率的困擾。這對于解決低親和力相互作用特別有問題，因為閱讀器蛋白在微摩爾范圍內具有解離常數(Kd)是常見的。此外，線性肽不能概括在三維核小體結構的背景下發生的體內相互作用。為了解決這些問題，EpiCypher 已經開發了一個敏感和強大的發現平臺，以利用含有不同翻譯后修飾(PTM)的多種重組核小體來詢問染色質閱讀器的結合，組蛋白變體，突變和/或 DNA 甲基化狀態。DCypher 染色質讀取器測定: 測量生理學染色質相互作用的同質生化測定。該測定利用 Perkin Elmer 的 AlphaScreenTM 技術，能夠定量評估讀取器結構域與核小體的相互作用(圖1A)。同質的“混合和測量"性質，沒有洗滌步驟，高靈敏度和穩健的方法使其成為詢問低親和力染色質讀者-核小體相互作用的理想選擇。HP1 something 是一個已建立的 H3K9甲基讀取子2，與單甲基、二甲基和三甲基結合(圖1B)。然而，當呈現 EpiCypher 設計者核小體(dNucs)時，HP1 something 僅對 H3K9me3顯示顯著增強的特異性(圖1C)。這些發現強調了在生物相關的核小體背景下研究表觀遺傳閱讀器相互作用的重要性。這里描述的協議允許終端用戶優化 dCypher 染色質閱讀器分析，首先使用 GSTtagedBRD4Bromodomain 1(BD-1)作為一個健壯的控制。然后，該方案可以容易地適應各種感興趣的表觀遺傳閱讀器結構域，不同的蛋白質標簽(例如 GST，His 或 FLAG) ，并且與 EpiCypher 不斷擴大的物素化核小體組合兼容。此外，這種方法可以用來計算 Kd 表面積，以更準確地比較相似的閱讀器和核小體結合對。圖1: 分析原理。用 dCypher 方法詢問染色質閱讀器。(A)將物素化的核小體固定在鏈霉親和素供體珠上，并且通過抗標簽綴合的 α 受體珠識別表位標記的染色質讀取器。供體的激光激發產生單線態氧，擴散激活受體的發射。熒光計數與核小體-讀取器相互作用橋接的供體-受體數量成正比。(B) HP1 something (0.15 nM)與物素化組蛋白肽的結合。(C) HP1 something (1nM)與物素化核小體的結合。

DCypher: 以高靈敏度和特異性詢問染色質讀數器鑒定和評估讀數器與核小體結合的測定

測定緩沖液120mM Hepes pH7.5,250mM NaCl，0.01% BSAadd 0.01% NP-40和1mM DTT 新鮮度測定緩沖液220mM Hepes pH7.5,250mM NaCl，0.01% BSA,添加0.01% NP-40新鮮標準協議注意: 在加入每種試劑后簡要地離心平板(≤800xg? 10秒)以最大限度地提高重現性 * 不要旋轉或超聲處理核小體溶液 * * 為了確定感興趣的讀取蛋白的最佳濃度，首先用已知的陽性和陰性對照進行滴定(例如圖2) * * * AlphaScreen 供體珠對光敏感，應該在柔和的照明下處理。* * * * 當使用鎳螯合受體珠時，建議使用10μg/mL SA 供體珠和2.5 μg/mL 受體珠。加入5μL 在測定緩沖液12中制備的4X 核小體 * (10nM 最終)。加入5μL 在測定緩沖液1 * * 3中制備的4X 染色質讀數器。在 RT4孵化30分鐘。在 DARK * * * 準備的測定緩沖液2 * * * * 5中加入10μL 2X 鏈霉親和素供體珠(5μg/mL)和谷胱甘受體珠(2.5 μg/mL)。在 RT6孵化60分鐘。閱讀使用阿爾法板讀取器: Ex680nm，Em 520-620nm

圖2: 蛋白質滴定法。在測試核小體文庫之前，讀取器結構域的最佳篩選濃度可以通過用已知靶核小體和陰性對照進行滴定來確定。對于 BRD4 BD-1，評估結合未修飾(rNuc，EpiCypher # 16-0006)和四乙?；?/span>(H4K5,8,12,16 ac，EpiCypher # 16-0313)核小體。理想的濃度范圍是30-200nM，提供足夠的信號超過背景和下面的鉤點(點信號開始下降后飽和的檢測試劑)。問: 如果我感興趣的讀者領域沒有已知的目標，或者如果我發現與組蛋白肽發現的已知的結合相互作用沒有在核小體上重現，我該怎么辦? 答: EpiCypher 科學家對不同類別的讀者領域和實驗優化有廣泛的經驗。請與我們聯系，建立一個科學！

圖3: BRD4 BD-1與 DCYPHER 核小體 K-ACYLSTAT 面板的結合。 EpiCypher 具有不斷擴展的核小體文庫，具有單獨和組合修飾。使用100nM 蛋白質評估 BRD4 BD-1與 dCypher K-AcylStat 面板的結合(參見圖2)。BRD4 BD-1對 H4K5,8,12,16 ac 具有特異性，對 H4上的個別乙酰修飾或 H3上的?；揎椌哂凶钚〉慕Y合。

用于染色質重塑研究的全重組核小體底物

概述染色質重塑，或核小體的重新定位，調節 DNA 通路，從而基因表達和基因組修復。許多 ATP 依賴性重塑酶復合物與人類疾病有關，但由于對基于核小體的底物的需求，是具有挑戰性的研究目標。EpiCypher 通過開發全重組重塑底物 EpiDyne 平臺來監測核小體沿 DNA 的重新定位，從而滿足了這一需求。在這里，我們證明了 EpiDyne-FRET 在使用熒光共振能量轉移(FRET)讀數的均勻重構分析中的應用。

染色質重塑作為治療目標異常的核小體組織能夠嚴重破壞基因表達、 DNA 修復和細胞分化，并且在人類疾病中發揮重要作用，包括癌癥、炎癥、自身免疫、精神分裂癥、心血管疾病和智力障礙。值得注意的是，近20% 的癌癥都包含來自 SWI/SNF 家族的 ATP 依賴性染色質重塑復合物的亞基突變。這些酶復合物通過“泵"組蛋白八聚體周圍的 DNA 來調節局部基因組的訪問，從而“滑動"核小體[1]。在多種癌癥中觀察到 SWI/SNF 亞基的復發性體細胞突變，支持腫瘤發生的驅動作用[2]。突變重塑蛋白是有吸引力的治療靶點，因為進一步降低其 ATP 酶活性促進癌細胞死亡，但節省正常細胞[2,3]。這種現象被稱為合成致死性，鑒定利用它的抑制劑可能導致具有癌癥特異性的藥物[4,5]。

染色質重塑檢測使用重組單核小體底物埃皮塞弗已經開發了表達式-熒光共聚染色質重塑酶復合物來研究其功能。核小體由包裹在 ~ 147bp DNA 中的核心組蛋白八聚體組成，代表染色質的基本重復單位。EpiDyne-FRET 由包裹在5’Cy3標記的 DNA 中的末端定位的組蛋白八聚體(H2AT120C * Cy5)組成[8](圖1)。在其組裝的起始位置，Cy3-Cy5 FRET 最大，當組蛋白八聚體重新定位(向模板 DNA 3’末端)或噴射時，通過 Cy5信號的丟失檢測到核小體重塑。圖1: EPIDYNE-FRET 核小體重塑底物由5’Cy3標記的 DNA (217bp; 綠色球)包裹的 Cy5標記的人組蛋白八聚體(H2A T120C-Cy5; 顯示為八聚體的紅色部分)組成，包括與核小體組裝難治性的 TGGA 重復區相鄰的末端核小體定位序列(147bp Widom 601[7])[8]。在組裝起始狀態下，Cy3-Cy5 FRET 達到最大值。當 Cy3標記的 DNA 5’末端從 Cy5標記的八聚體移開時，通過 FRET 信號的還原檢測 ATP 依賴性重塑劑(例如 RSC 或另一種 SWI/SNF ATP 酶)的活性。EpiDyne-FRET 是一種與 HTS 應用立即兼容的一步免洗方法。

測定所需的試劑和材料[見注(i)]•酵母 RSC [9](底物也與 dACF [ ACF-ISWI ] ，dNoRC [ Toutatis-ISWI ]和人 SMARCA2/4(BRG1/BRM)相容; 數據未顯示)• EpiDyne-FRET 核小體重塑底物(EpiCypher 目錄號16-4201)•測定緩沖液(20mM Tris pH 7.5,50mM KCl，3mM MgCl 2和0.1 mg/mL BSA (Sigma 目錄號。A3059)• ATP (Invitrogen 目錄號。PV3227)•可選: ATPγS (一種非水解形式的 ATP)• Corning 3820384孔測定板(Fisher Catalog No. 07-200-891)•用于384孔板的16通道多頻儀•384孔熒光微板讀數器能夠進行 Cy3/Cy5-FRET 檢測(例如 Envision，Perkin Elmer)標準協議1。根據預期的時間點/重復(一式三份)確定所需的 RSC (10nM 最終) ，EpiDyne-FRET (20nM 最終)和 ATP (2mM 最終)的量[參見注釋(ii & iii)]。準備反應組分(室溫)。I. 2x 酶/底物溶液(20nM RSC + 40nMEpiDyne-FRET 底物在2x 測定緩沖液中)。2x ATP +/-抑制劑溶液(所需的 ddH2O + 抑制劑[例如 ATPγS ]中的4mM ATP)3。加入5μL 的2倍酶/底物溶液到微孔板上。4。通過加入5μL 的2xATP +/-抑制劑溶液來啟動反應。5。在適當的時間點，在384孔板讀取器中讀取，能夠檢測到 Cy3(激發 -531nm/發射 -579nm)/Cy5(發射 -685nm)。數據表示為原始 Cy3和 Cy5發射信號在每個時間點的比值[8]。

注意事項(i)把蛋白樣本貯存在攝氏零下80度，并避免冷凍/解凍。(ii)對于測定開發，建議對多種反應組分(包括酶、底物和 ATP)的濃度進行滴定。(iii)由于數據表示為 Cy3-Cy5發射，因此重要的是不要在這些反應中添加多余的底物。(iv)反應可迅速開始。如果設置一個大板沒有一個自動注射器有沒有一個能力的 T0為每個條件。2018年，NC。所有權利保留  由染色質重塑復合物 NURF 介導的 ATP 依賴性組蛋白八聚體滑移。1999年的牢房。97(7) : p. 833-42.2.SMARCA2/4 ATP 酶結構域在 SWI/SNF 突變型癌癥中超越 Bromodomain 作為藥物靶點: 來自 cDNA 拯救和 PFI-3抑制劑研究的見解。巨蟹座，2015年。75(18) : p. 3865-78.3.針對染色質重塑 BRG1增加了化藥物在乳腺癌細胞中的療效。腫瘤目標，2016年。7(19) : p. 27158-75.4.Helming，K.C. ，X. Wang，and C.W. Roberts，突變 SWI/SNF 復合物在癌癥中的脆弱性。癌細胞，2014年。26(3) : p. 309-17.5.Karnezis，A.N. 等，SWI/SNF 復合物 ATP 酶 SMARCA4/BRG1和 SMARCA2/BRM 的雙重喪失對于卵巢高鈣血癥型小細胞癌是高度敏感和特異性的。JPathol 2016年。238(3) : p. 389-400.6.Clapier，C.R. ，等，染色質重塑者 RSC/Sth1中 DNA 易位效率的調節增強核小體的滑動和射出。Mol Cell，2016年。62(3) : p. 453-61.7.Lowary 和 J.Widom，高親和力結合組蛋白八聚體的新 DNA 序列規則和序列定向核小體定位。J Mol Biol 1998年。276(1) : p. 19-42.8.等人，TGGA 重復損害核小體的形成。J Mol Biol 1998年。281(2) : p. 253-60.

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